与此同时，他的个人威望也达到了顶峰，成为东晋朝廷中无人能及的军事强人。

随着军事功勋的积累与地盘的扩大，王敦的权势日益膨胀，逐渐超出了晋元帝司马睿的掌控范围。

他在荆州、江州等地自行任免官吏，征收赋税，形成了独立于朝廷的地方割据势力；他大肆安插亲信与琅琊王氏子弟担任要职，朝堂之上，王氏子弟遍布，形成了“王氏子弟皆列卿相”的局面；甚至连东晋的禁军，都有他的亲信渗透，司马睿的一举一动都在他的监视之下。

晋元帝司马睿虽为皇帝，却形同傀儡，对王敦的专权日益不满。

他深知，若任由王敦势力发展，东晋政权终将被琅琊王氏取代。

于是，司马睿暗中扶持刘隗、刁协等寒门出身的大臣，试图通过他们削弱王氏势力：任命刘隗为镇北将军，率军驻守淮阴，以防备王敦；任命刁协为尚书令，执掌中枢政务，推行抑制门阀的政策；同时，司马睿还试图收回王敦的兵权，限制其任免官吏的权力。

司马睿的这些举措，彻底激化了他与王敦之间的矛盾。

王敦自恃拥立之功与军事优势，对司马睿的“削权”行为极为不满，多次上书朝廷，指责刘隗、刁协“谗佞惑主，擅作威福”，要求罢免二人。

但司马睿不为所动，反而进一步加强对王敦的防范。

双方的矛盾从暗中角力逐渐走向公开对立，一场大规模的军事冲突已不可避免。

东晋永昌元年（322年）正月，王敦以“清君侧”为名，在武昌起兵，率领水陆大军顺江而下，直指建康，发动了第一次叛乱。

他在檄文中历数刘隗、刁协的罪状，声称“隗首乱阶，协同恶相济，祸加宗室，毒流士庶”，表示此次起兵的目的是“诛隗翦协，以清王室”，并非针对晋元帝司马睿。

王敦的叛乱，得到了部分门阀士族的暗中支持。

由于司马睿重用刘隗、刁协等寒门大臣，推行抑制门阀的政策，触动了许多士族的利益，他们虽不公开支持王敦叛乱，却采取了观望态度，不愿为朝廷效力。

而王敦麾下的军队，经过多年的训练与征战，战斗力极强，加之他早有准备，粮草充足，因此叛军进展神速，很快便攻占了芜湖、姑孰等重镇，兵临建康城下。

面对王敦的叛军，晋元帝司马睿仓促应战，任命刘隗、刁协率军防守建康，同时征召各地将领率军勤王。

但此时的东晋朝廷，军队战斗力薄弱，且缺乏统一指挥，各地将领要么畏惧王敦的军威，要么持观望态度，勤王军队迟迟未能集结。

刘隗、刁协虽忠心耿耿，却缺乏军事才能，加之麾下士兵多为临时征召，军心涣散，与叛军一触即溃。

叛军攻破建康外城后，王敦放纵士兵劫掠，城内火光冲天，百姓流离失所，一片狼藉。

晋元帝司马睿见大势已去，无奈之下，派人向王敦求和，表示愿意罢免刘隗、刁协，满足其要求。

但王敦并不罢休，继续率军猛攻内城。刘隗、刁协见建康难保，仓皇出逃：刁协在逃亡途中被随从所杀，首级被献给王敦；刘隗则历经艰险，投奔了北方的后赵政权，最终客死他乡。

王敦进入建康后，并未直接废黜晋元帝司马睿，而是以胜利者的姿态掌控了朝政。

他首先诛杀了司马睿的亲信大臣周顗、戴渊等人，以清除朝廷中的反对势力；随后，他任免百官，将琅琊王氏及亲信势力安插至朝廷关键岗位：王导进位太傅，录尚书事，执掌中枢；王敦自任丞相、都督中外诸军事、录尚书事，封武昌郡公，享有“剑履上殿，入朝不趋，赞拜不名”的特权，权势达到顶点。

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此时的王敦，名为丞相，实为摄政王，晋元帝司马睿完全被架空。

他在朝廷中独断专行，生杀予夺全凭一己之意，朝堂上下无人敢违抗其命令。

司马睿经此一役，心力交瘁，加之大权旁落的屈辱与愤懑，很快便一病不起。

永昌元年（322年）闰十一月，晋元帝司马睿忧愤而死，太子司马绍即位，是为晋明帝。

晋明帝即位后，深知自己羽翼未丰，无力与王敦抗衡，因此表面上对王敦恭顺有加，不断加官晋爵，以麻痹其警惕心；暗地里，他却积极联络反对王敦的势力，积蓄力量，等待反击的时机。

王敦虽察觉到晋明帝的意图，但此时他已年老多病，加之认为晋明帝不足为惧，因此并未立即采取行动，这为他日后的失败埋下了隐患。

东晋太宁二年（324年），王敦的病情日益加重，身体每况愈下。

他深知自己时日无多，若不趁生前夺取皇位，琅琊王氏的权势将难以维系。

于是，王敦决定再次起兵叛乱，彻底推翻东晋政权，建立王氏王朝。

为了确保叛乱成功，王敦进行了周密的部署：任命侄子王应为元帅，统领叛军；任命钱凤、沈充等亲信为将领，率军进攻建康；同时，他还联络了江东的部分豪强势力，约定共同起兵。

王敦深知自己无法亲自指挥军队，因此在起兵前，他对王应、钱凤等人反复叮嘱作战方略，要求他们迅速攻占建康，控制晋明帝。

然而，此时的局势已与第一次叛乱时大不相同：一方面，晋明帝早有准备，他在暗中联络了王导、郗鉴等反对王敦叛乱的大臣，形成了统一的抗叛联盟；另一方面，王敦的叛乱行为已彻底暴露了其篡权夺位的野心，引起了广大士族与百姓的不满，叛军失去了民心支持；此外，王敦病重的消息传开后，叛军内部军心涣散，将领们各怀异心，缺乏统一的指挥与协作。

王导作为琅琊王氏的核心成员，始终以维护东晋朝廷稳定与家族利益为己任。

他对王敦的第一次叛乱虽未公开反对，但也并不赞同其独断专行；对于王敦的第二次叛乱，王导更是明确表示反对，因为他深知，若王敦篡权失败，琅琊王氏将面临灭顶之灾。

得知王敦病重起兵后，王导立即采取行动，公开宣称王敦已死，伪造了王敦的死讯，号令天下讨伐“伪帅王应”。

这一举措极大地动摇了叛军的军心，叛军士兵误以为主帅已死，顿时士气低落，人心惶惶。

同时，王导被晋明帝任命为大都督，率军防守建康，他积极组织兵力，加固城防，联络各地勤王军队，形成了对叛军的合围之势。

江东士族与各地将领见王导站在朝廷一边，纷纷响应晋明帝的号召，率军勤王。

叛军在进攻建康的过程中，遭到了朝廷军队的顽强抵抗，多次进攻均以失败告终。